据介绍,禽感病毒是含有8个RNA基因组片段的负链RNA病毒,已知可以编码11种病毒蛋白质。其中,PB1、PB2和PA等3个蛋白质亚基组成流感病毒重要的生命机器:流感病毒RNA聚合酶。在禽流感病毒的复制和感染的过程中,流感病毒聚合酶发挥了至关重要的作用,它负责行使病毒基因组RNA的复制以及病毒mRNA转录等多方面功能。其中,PB2蛋白负责捕捉宿主细胞的mRNA分子用于自身mRNA转录,PB1含有聚合酶活性中心,是行使病毒NA的合成功能的催化亚基,而PA在该复合体的功能一直没有明确。研究流感病毒聚合酶的结构,不仅仅对揭示流感病毒聚合酶的作用机制具有重要的科学意义,还将对临床上抗病毒药物的研发提供清晰的分子模型。但是,由于在研究这一复合体中存在种种困难,这一复合体或者其组成的亚基的结构一直没有被揭示。
刘迎芳和饶子和抓住这一问题不放,终于逐步系统地解析了H5N1毒株RNA聚合酶复合体PA亚基的基本结构。通过对该结构的分析,他们推测,该蛋白有可能是一个具有新型结构的核酸内切酶。据此,他们进一步开展了一系列的体内和体外的分子生物学、生物化学实验分析,其结果充分证实了他们根据结构分析所作出的推测是正确的。该内切核酸酶活性将使聚合酶复合体捕获的宿主细胞mRNA,被流感病毒聚合酶内切酶切割,以用于病毒mRNA转录。这一活性的缺失,将造成病毒不能在细胞内转录mRNA。这一结论首次清晰地揭示了PA参与病毒转录功能的一个重要分子机制,同时还首次证明了禽流感病毒RNA聚合酶中所具有的核酸内切酶功能是在PA亚基上,而不是在以往人们报道的PB1亚基上。这一研究结果不仅揭示了PA的功能机制,而且还为相关药物研发提供了一个新的原子水平的精细结构平台。
据中科院生命科学与生物技术局相关人士介绍,目前,除了国内禽流感疫情外,由于禽鸟迁徙等原因,我国周边国家的禽流感疫情也不容忽视。印尼是目前世界上禽流感疫情最严重的国家,截至2008年底,该国共发生人感染禽流感病例139例,其中113人死亡;越南仅次于印尼,截至2008年底,共有107个病例,其中52人死亡。此外,印度、孟加拉、越南也陆续暴发疫情。尽管由于各国加强监督及加速扑杀可能染病的家禽,在亚洲,至今已有高达5亿只家禽死于禽流感或为控制疫情而被扑杀,H5N1致命病例过去两年连续减少,家禽暴发疫情的国家近年也减少了,但是禽流感的威胁始终挥之不去。自2003年暴发疫情后,H5N1一直保持在“最低程度的散发,多次却骤然爆发”状态。
PAN结构
刘迎芳说,在此项最新研究工作中,英国牛津大学的Ervin Fodor博士及Tao Deng博士、新加坡国立大学Ruowen Ge博士等亦参与了部分研究工作,美国APS同步辐射中心教授张荣光在数据收集中也提供了帮助。此外,中国农科院陈化兰、于康镇教授提供了病毒基因。
该研究课题得到了国家自然科学基金委、科技部和中国科学院的扶持和资助。
推荐原始出处:
Nature advance online publication 4 February 2009 | doi:10.1038/nature07720
Crystal structure of an avian influenza polymerase PAN reveals an endonuclease active site
Puwei Yuan1,6, Mark Bartlam2,6, Zhiyong Lou3,6, Shoudeng Chen1, Jie Zhou1, Xiaojing He1, Zongyang Lv1, Ruowen Ge4, Xuemei Li1,3, Tao Deng2,5, Ervin Fodor5, Zihe Rao1,2,3 & Yingfang Liu1
1 National Laboratory of Biomacromolecules, Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China
2 College of Life Sciences and Tianjin Key Laboratory of Protein Science, Nankai University, Tianjin 300071, China
3 Laboratory of Structural Biology, Tsinghua University, Beijing 100084, China
4 Department of Biological Sciences, National University of Singapore, Singapore 117543
5 Sir William Dunn School of Pathology, University of Oxford, Oxford OX1 3RE, UK
6 These authors contributed equally to this work.
The heterotrimeric influenza virus polymerase, containing the PA, PB1 and PB2 proteins, catalyses viral RNA replication and transcription in the nucleus of infected cells. PB1 holds the polymerase active site1 and reportedly harbours endonuclease activity2, whereas PB2 is responsible for cap binding2, 3, 4. The PA amino terminus is understood to be the major functional part of the PA protein and has been implicated in several roles, including endonuclease5 and protease activities6 as well as viral RNA/complementary RNA promoter binding7. Here we report the 2.2 ?ngstr?m (?) crystal structure of the N-terminal 197 residues of PA, termed PAN, from an avian influenza H5N1 virus. The PAN structure has an / architecture and reveals a bound magnesium ion coordinated by a motif similar to the (P)DXN(D/E)XK motif characteristic of many endonucleases. Structural comparisons and mutagenesis analysis of the motif identified in PAN provide further evidence that PAN holds an endonuclease active site. Furthermore, functional analysis with in vivo ribonucleoprotein reconstitution and direct in vitro endonuclease assays strongly suggest that PAN holds the endonuclease active site and has critical roles in endonuclease activity of the influenza virus polymerase, rather than PB1. The high conservation of this endonuclease active site among influenza strains indicates that PAN is an important target for the design of new anti-influenza therapeutics.