摘要：传统上，代谢性疾病新疗法的开发主要依赖于使用生化或基于细胞的分析的高通量筛选。虽然这种方法代表了药物发现的推动力，但也需要在不破坏器官间通信和组织结构的情况下进行大规模筛选，这些是理解代谢调节的复杂性以及识别具有适当生物活性的小分子的必要组成部分。因此，斑马鱼在代谢研究和药物发现中越来越受欢迎，因为这种动物模型允许在整个生物体内筛选小分子。此外，斑马鱼表现出胰腺、肝脏和脂肪组织的保守功能，这些功能可用于识别新代谢调节靶点，以及研究与人类代谢性疾病风险相关的保守基因的作用。在此，我们重点介绍使用斑马鱼作为模型在代谢调节目标识别方面的最新进展。我们首先描述包括肝脏、胰腺和脂肪组织的主要代谢器官的发展和存在学。

 

斑马鱼的代谢调节：通常，繁殖一对斑马鱼可以产下几百个受精卵，这些卵迅速发育成具有包括胰腺和肝脏在内的功能代谢器官的幼鱼。由于它们的体积小，几个胚胎或幼鱼可以在96孔板中适应和发育。基于发育特征的表型检查或通过可视化具有细胞类型特异性表达的转基因来允许它们在药物筛选中使用。例如，在幼鱼麻醉后，在广角显微镜下使用荧光报告器可以直接观察肝脏和胰腺。斑马鱼幼鱼肝脏和胰腺在调节新陈代谢中的功能作用得到了一些实验证据的支持。 例如，使用遗传系统破坏胰腺β细胞会导致快速高血糖，这种高血糖只有在足够数量的β细胞再生后才会恢复到基础状态。此外，幼鱼和成鱼对降糖剂如胰岛素、延长素-4或抗糖尿病药物吡格列酮、格列本脲和二甲双胍表现出保守的反应。早期幼鱼有趣的代谢特征是，即使没有外部营养，其全身葡萄糖水平也显示出变化，这反映了肝脏葡萄糖生产的变化。特别是，在受精后5天左右，斑马鱼幼鱼排出其卵黄细胞中母体来源的养分储存，其中脂质在动员到胚胎体之前被处理。在蛋黄耗竭的这段时间，肝脏对禁食表现出哺乳动物的反应，并上调糖异生以补偿能量储存的下降，导致葡萄糖浓度增加。这种反应通过增加空腹反应基因胞浆磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pck1)在肝细胞中的表达而实现。值得注意的是，斑马鱼体内的一些遗传和环境干扰可以模拟肝脏疾病，如纤维化和脂肪变性。这种模式已经允许识别控制这一过程的新的促再生信号和小分子。斑马鱼幼鱼在6dpf左右开始独立进食，并且随着它们发展成幼鱼（在30dpf左右）而迅速生长，随后在90dpf左右发育成性成熟的成鱼。随着喂养的开始，血糖浓度变得依赖于营养，并遵循以膳食为基础的模式。此外，随着独立进食的开始，白色脂肪细胞开始在皮下和腹部内积聚，后者类似于人类发现的内脏脂肪组织(VAT)。值得注意的是，脂肪细胞可以用亲脂性荧光染料非激活地显示，因为它们的质量分别随着长时间的禁食或过量进食而缩小或扩大。斑马鱼已经建立了几种增加肥胖的遗传模型。值得注意的是，斑马鱼不具有哺乳动物中存在的褐色脂肪细胞。

 

葡萄糖稳态的目标识别：如上所述，早期幼鱼表现出葡萄糖水平的自然增加，这为寻找降糖剂提供了简单的体内环境。最近，Nath等人应用荧光葡萄糖检测法，筛选出7000多种新型降糖剂。该筛选确定了阿列西定，它抑制PTEN样线粒体磷酸酶PTPMT1，并通过激活琥珀酸脱氢酶和增加能量消耗导致葡萄糖浓度降低。不同的筛选利用置于空腹反应基因启动子pck1控制下的萤火虫-萤光素酶的表达，产生肝葡萄糖异生的转基因报告。斑马鱼转运蛋白（TSPO）的选择性和高亲和力配体，其促进斑马鱼幼鱼空腹样能量状态。TSPO是一种外线粒体膜蛋白，控制胆固醇的摄入以及随后的类固醇和神经类固醇的产出。证明用斑马鱼鉴定的小分子在哺乳动物代谢调节中显示出保守作用。

 

胰腺β细胞可塑性靶点的鉴定：斑马鱼为研究β细胞的发育和再生提供了独特的优势，因为可以使用在斑马鱼胰岛素启动子下表达的荧光蛋白来显示它们的β细胞。斑马鱼β细胞起源于胰腺背侧和腹侧的芽，它们结合形成胚胎胰岛。与小鼠胰岛相似，β细胞位于胰岛核心，而α细胞则占据外周。斑马鱼胰岛也是血管密集和神经支配的。在胚胎后发育过程中，胰腺在腺泡细胞中形成许多附加的次级胰岛，这些次级胰岛与Sox9b阳性祖细胞不同。这种分化类似于小鼠胰腺中的次级转变。值得注意的是，斑马鱼β细胞通过增殖和分化来增加其质量，从而对营养过剩作出反应，但是也和哺乳动物一样，在胰岛素抵抗期间失败。最近使用斑马鱼转基因骨骼肌胰岛素抵抗模型证实了这一点。最近利用基因编码的钙指示剂GCaMP6s表征了β细胞功能的发展。幼鱼的β细胞开启了斑马鱼β细胞成熟标志物Urocortin 3(Ucn3)的正交表达。我们的发现打开了使用半透明斑马鱼幼体的大门，以便识别控制β细胞功能成熟的信号通路，这是从干细胞分化出功能性人类β细胞的重要步骤。斑马鱼中的β细胞似乎比哺乳动物的β细胞再生能力更强。即使在成人，空腹血糖水平在近完全消融β细胞两周内也恢复正常，而不需要胰岛素注射来维持生存。这种惊人的再生能力依赖于通过从中心腺泡细胞分化或从α细胞转化成β细胞的去新生β细胞的形成，然后新形成的β细胞增殖。斑马鱼和哺乳动物再生潜能的区别为寻找新的促再生信号提供了一个有趣的模型。例如，最近一项基因筛查发现，胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP1）在肝脏中由于β细胞消融而上调。反过来，IGFBP1通过促进α到β细胞的反分化而增强β细胞的再生。另一项最近的研究还发现了一种保守的细菌蛋白（β细胞膨胀因子A）的作用，它是从肠道微生物中分泌的，在发育过程中似乎影响β细胞质量的可塑性。这些信号能否用于促进哺乳动物β细胞再生还有待观察。

 

利用哺乳动物细胞为基础的方法，寻找新的β细胞营养因子正在进行深入研究，以期确定糖尿病中β细胞大量补充的新疗法。与基于细胞的方法不同，斑马鱼允许识别可能间接刺激β细胞质量扩张的分子。已经进行了几个化学筛选，目的在于鉴定增强β细胞再生或促进β细胞增殖和分化的化合物。例如，用于选择性β细胞消融的系统的开发允许约7000小分子被筛选用于增强β细胞再生。该筛选鉴定了腺苷激动剂5′-N-乙基甲酰胺腺苷（NECA）作为有效的再生诱导剂。NECA还通过促进β细胞增殖促进糖尿病小鼠模型中的β细胞再生。此外，孕期小鼠β细胞中腺苷受体A2的缺失损害了代偿性β细胞增殖。第二个筛选使用了基于荧光泛素化细胞周期指示剂(FUCCI)的创新技术，该技术允许基于增殖细胞中特异性表达GFP直接定量β细胞增殖。使用FUCCI报告系统筛选900个小分子，鉴定出临床批准的调节三种信号通路的药物：血清素、维甲酸和糖皮质激素。鉴于5-羟色胺信号和糖皮质激素在哺乳动物β细胞增殖中的保守作用，这些结果突出了在斑马鱼中筛选的巨大潜力。

 

斑马鱼遗传学在目标识别中的应用：关键问题是斑马鱼的新陈代谢和基因功能是否足够保守，以准确模拟人类疾病。当然，斑马鱼是一种强大的遗传模型，因为它可以轻松地产生具有组织特异性的过表达候选基因的系。此外，CRISPR和TALENs可用于靶向基因破坏。此外，还开发了控制基因功能的新的光遗传学方法，因为它们非常适合于半透明的斑马鱼胚胎和幼鱼。 因此，斑马鱼有希望提高研究与人类代谢障碍相关的候选基因的能力，只要它们表现出足够的保守性。将来，将有更多关于哺乳动物和斑马鱼之间代谢保护的信息。然而，许多研究已经用斑马鱼模拟了影响代谢性疾病的遗传和环境因素。例如，FOXN3基因第一内含子中的SNP(rs8004664)与人空腹血糖相关。斑马鱼或人FOXN3在斑马鱼肝细胞中的转基因过表达导致高血糖，使FOXN3在肝糖异生中的机制分析成为可能，同时鉴定MYC为保守的下游靶点。总之，这些研究提供了在代谢调节方面进化保守的参与者的例子，这大大增加了使用斑马鱼来模拟人类疾病的兴趣。然而，随着更多的研究被发表，对这种保护的有趣的例外可能被揭露。例如，瘦素受体缺失的斑马鱼表现出葡萄糖稳态紊乱，而没有出现小鼠模型中描述的过度出血或肥胖。

 

结论：我们重点展示了斑马鱼作为寻找代谢调节目标模型的多功能性。使用斑马鱼模型来识别调节食欲控制的小分子和遗传网络，葡萄糖内稳态的中枢调节，炎症在代谢功能障碍中的作用，以及微生物与代谢之间的相互作用。此外，斑马鱼的高再生能力可以用来解锁促进其他代谢器官再生的新信号，而不仅仅是β细胞。然而，仍然存在许多挑战，例如，有必要开发产生组织和细胞特异性基因敲除的可靠方法。此外，需要建立免疫介导的β细胞破坏和代谢性疾病的年龄相关并发症的生理模型，以便斑马鱼充分发挥其作为强有力的临床前模型的潜力。