摘要：全氟己烷磺酸（PFHxS）是一种短链全氟烷基物质，广泛应用于工业和消费领域。然而，关于PFHxS毒性的分子机制（如脂质代谢）的信息有限。本研究提供了有关暴露和未暴露全氟己烷磺酸的斑马鱼胚胎脂质调节的详细信息。整个斑马鱼发育过程中（受精后 4 到 120 小时（hpf））的脂质变化与脂质种类和脂质组成（脂肪酰基链）密切相关。对斑马鱼不同发育阶段（24、48、72 和 120 hpf）的四种不同全氟己烷磺酸暴露量（0、0.3、1、3 和 10 μM）进行了全面的脂质分析。有关暴露浓度、血脂和发育阶段的数据表明，所有PFHxS浓度均导致脂质代谢失调且这些均依赖于发育。脂质发生显著变化的模式表明，全氟己烷磺酸引起的影响与氧化应激、炎症和脂肪酸 β-氧化受损有关。氧化应激和炎症导致甘油磷脂（磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰乙醇胺（PE））的重塑，ω-3多不饱和脂肪酸的掺入增加，ω-6多不饱和脂肪酸的掺入减少。

关键词：斑马鱼胚胎   发育阶段  PFHxS  PFAS  作用方式  脂质组学

简介：全氟己烷磺酸 (PFHxS) 已广泛用于各种应用，例如消防泡沫、表面活性剂以及防水和防污涂料。它的链（C6）比全氟辛烷磺酸（PFOS，C8）短。由于强碳氟键，全氟己烷磺酸具有抗热、化学和生物降解能力，这导致全氟己烷磺酸普遍存在于各种环境基质中，例如饮用水（<0.15–7.1 ng/L）、室内灰尘(<0.1–120 ng/g) 和沉淀物 (0.027–8.12 ng/g)。人类的主要摄取途径是食物和饮用水。 由于其生物累积特性，这种化学物质经常在许多生物样品中检测到，例如人血清 (1.35–7.7 μg/L) 和牛奶 (<0.04–0.087 μg/L)。因此，PFHxS受到越来越多的关注，并对其对人类、野生动物和环境的潜在风险表示担忧。人类流行病学研究报告了全氟己烷磺酸与非酒精性脂肪肝、糖尿病和行为改变等人类疾病之间的关联。越来越多的体外和体内研究表明，全氟己烷磺酸可能导致神经毒性、内分泌紊乱、细微的形态、行为和基因表达变化以及细胞凋亡。一项体内研究表明脂肪代谢发生了改变，该研究报告称，暴露于 PFAS 会导致雄性小鼠后代肥胖。 其他研究表明，全氟己烷磺酸正在改变脂质代谢。Pfohl等人报道，PFHxS（约0.15 mg/kg/d）可导致饮食失调诱导肥胖小鼠肝脏和血清中的脂质代谢紊乱以及氧化应激。Das等人发现PFAS（包括10 mg/kg/d的PFHxS）会破坏脂肪酸合成和氧化之间的平衡，导致小鼠肝脏脂肪变性。此外，流行病学研究表明，接触PFHxS与人类脂质谱改变有关。然而，PFHxS如何影响脂质的机制尚不清楚。大多数研究使用与不良健康结果密切相关的广泛指标深入了解了PFHX的毒性效力，但对导致这些结果的PFHX毒性作用模式知之甚少。PFHxS对脂质谱的影响，包括脂质种类和结构信息（脂肪酰基链），将为PFHxS毒性的分子机制提供新的知识。

在本研究中，我们旨在利用脂质组学来阐明PFHxS的毒性作用模式。脂质组学是代谢组学的一个子类，是一种新兴工具，可用于对各种样品（例如细胞、组织和生物体）中具有广泛物理化学特性的数千种不同脂质进行高通量分析。脂质在细胞膜、信号信使、能量储存和生物活性介质等元素中发挥重要作用。 脂质参与许多代谢途径并且在生物体之间高度保守。 它们代表了病理状态的瞬时快照，并且与上游组学和下游表型密切相关。除脂质种类外，脂质链组成的变化与生物发育、人类疾病和环境应激因素密切相关。液相色谱 (LC) 与高分辨率质谱 (HRMS) 耦合被广泛用于全面的脂质分析。MS 和 MS/MS 光谱可用于识别单个脂质及其脂肪酰基链。斑马鱼已广泛用于环境化学品的毒性研究。 与脂质代谢和转运蛋白相关的基因在斑马鱼和脊椎动物之间高度保守，使其非常适合脂质组学研究。斑马鱼胚胎暴露于 4.4-80  μM的全氟己烷磺酸，在明暗转换测试中显示出弯曲的尾巴、鱼鳔失衡、膨胀和行为差异。到目前为止，还没有关于全氟己烷磺酸对斑马鱼发育过程中脂质或脂质代谢影响的研究。但是，已经证明，相关的全氟辛烷磺酸（0.5μM）可以改变暴露成年斑马鱼及斑马鱼后代的脂质代谢。根据目前的知识，我们假设PFHxS能够改变脂质代谢。为了提高我们对这些脂质变化和潜在机制的理解，我们对发育过程中暴露于不同浓度PFHX的斑马鱼胚胎进行了脂质组学研究。为了提高我们对斑马鱼早期发育过程中脂质代谢的理解，我们首先建立了斑马鱼胚胎发育过程中的全面脂质谱。因此，研究了不同发育阶段（受精后4、24、48、72和120小时）的脂质组。

与发育相关的脂质谱变化：尽管以前的研究报告了斑马鱼发育过程中不同脂质类别的总脂质含量的变化，但我们的研究旨在跟踪个体脂质的变化，重点关注可能在发育和发育生物学过程中发挥独特作用的各种脂肪酰基链。在我们的研究中，可以在斑马鱼胚胎中分析各种类型的脂质，包括脂肪酰基 (FAs)、甘油磷脂 (GPLs)、甘油脂 (GLs)、鞘脂 (SPs)、胆固醇和氧化脂质。共有 532 种脂质用 MS/MS 光谱进行了分析，其中磷脂酰胆碱 (PC) 和磷脂酰乙醇胺 (PE) 以及醚类脂质的数量最多。基于非靶向脂质组学的PLS-DA图表明，发育中的斑马鱼的脂质谱从 4 到 120 hpf 不等。

图 1. (A) 基于个体脂质的标准化峰面积绘制斑马鱼不同发育阶段脂质谱的 PLS-DA 评分图。 显示的是 4、24、48、72 和 120 hpf 的数据

图 2 显示了一组选定的、代表各种脂质类别的显著改变的脂质。在斑马鱼发育过程中与4 hpf相比，多不饱和脂肪酸（PUFA）水平持续升高。许多 PUFA，如花生四烯酸 (AA)、二十碳五烯酸 (EPA) 和二十二碳六烯酸 (DHA)，是支持斑马鱼和儿童神经系统发育和大脑正常功能的重要元素。据报道，与 PUFA 合成相关的基因，即脂肪酰基去饱和酶 (Fad) 和 Elovl5 和 Elovl2 样延长酶，在斑马鱼的早期发育过程中高度表达，这与当前研究中二酰基甘油（DGs）、PEs和PCs中多不饱和脂肪酸浓度的增加有关。属于脂肪酸酰胺的主要N-酰基乙醇胺（NAE）也是如此。据说这些 NAE 在大脑的发育和功能中很重要，并作为内源性大麻素。文献还表明，脑内NAE 16:0与神经保护和鱼类摄食有关。此外，有研究报告多不饱和脂肪酸和NAE有助于生物体内的氧化还原平衡。鞘脂（如鞘磷脂（SMs）和神经酰胺）是细胞膜的重要组成部分，在大脑中尤其丰富，可以作为信号信使。在目前的研究中，大多数鞘脂在发育过程中增加，这与另一项研究一致。游离胆固醇也是如此，在斑马鱼的发育过程中也会增加。 胆固醇参与类固醇和胆汁酸的合成，并影响细胞膜的生物物理特性。 在小鼠胚胎发育过程中，胆固醇合成效率低下会导致脑部疾病和其他异常。

图2、相对于4 hpf，一组选定脂质的Log2 倍数变化。

甘油磷脂 (GPL) 在发育中的斑马鱼中表现出更复杂的水平变化。 GPL是细胞膜的重要组成部分和生物活性介质的前体。磷脂酰胆碱（PCs）是斑马鱼胚胎中含量最丰富的GPL，其次是溶血磷脂酰胆碱（LPCs）、乙醚类PCs和PEs。不同发育阶段PCs总含量的变化与另一项研究一致，即卵黄中PCs总含量从0到24 hpf增加，然后急剧下降。最丰富的PC和PE物种为PC 16:0/18:1和PC 16:0/22:6，以及PE 18:0/22:6，这与斑马鱼发育研究一致。在胚胎发生过程中，个体 PC 和 PE 的水平遵循不同的模式。 具体而言，发现了两种不同的趋势，并与 PC 的脂肪酰基链有关。

PFHxS暴露对血脂的调节：与其他研究类似，在任何测试浓度下均未观察到视觉异常。仅对受精后5天（dpf）暴露于10μM的胚胎进行体长测量，未检测到显著差异。这与该研究一致，该研究也未检测到在 96 hpf 时高达 56 μM PFHxS 的生长有任何差异，而较早的研究显示在 5 dpf 时 2 和 20 μM 的生长效应。在同一阶段，除 120 hpf下的1μM PFHxS组外，暴露组和对照组之间的总脂质含量没有差异，这也表明对生长没有总体影响。PFHxS显著改变的脂质主要是FAs、GPLs、GLs和SPs，一些特异性改变的脂质与氧化应激和炎症、防御机制、脂肪酸β-氧化等有关。并不是所有的脂质都持续受到PFHxS的影响，因为随着斑马鱼的发育，脂质谱发生了变化。例如，在斑马鱼发育过程中，指示氧化应激和炎症的受影响脂质数量增加。揭示受影响的脂质模式是阐明全氟己烷磺酸在斑马鱼胚胎中潜在作用模式的合适方法。发育阶段比暴露浓度更重要。 总体而言，在斑马鱼胚胎中暴露于全氟己烷磺酸显示出非单一的脂质剂量反应曲线。例如，在120 hpf时，发现1μM PFHxS的PC脂质变化比其他浓度高出一倍。这种非单一效应的观察结果与之前对斑马鱼和PFAS的研究一致。另一方面，受PFHxS影响的脂质数量在24-48 hpf之间急剧增加，大多数脂质在120 hpf时受到影响。PLS-DA图显示，在发育过程中，暴露组的脂质分布偏离了对照组，暴露浓度之间的差异增加。这些发现表明，在一定浓度下，PFHxS的效力取决于发育阶段。作者推测，这种摄取差异是48 hpf左右绒毛膜的保护功能以及生物积累增加的综合结果。

图3、暴露于不同浓度PFHxS的斑马鱼胚胎中单个脂质标准化峰面积的PLS-DA评分图。

PFHxS对受干扰的脂质的解释：脂肪酰基：这项研究表明，PFHxS破坏的脂肪酰基包括多不饱和脂肪酸、酰基肉碱（CARs）和NAE。接触全氟己烷磺酸导致 DHA (22:6n-3) 水平在 120 hpf 时显著下降。其他研究表明，DHA 水平降低表明存在氧化应激和炎症反应。我们观察到 ω-3多不饱和脂肪酸衍生的NAE的浓度从72 hpf至120 hpf下降。根据先前的研究，这些NAE可以减少促炎细胞因子（例如白细胞介素-6（IL-6）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1））和NO的产生，这与抗炎特性有关。除水解外，多不饱和脂肪酸衍生的NAE的代谢是通过氧化酶（例如COX、LOX（脂氧合酶）和CYP450）实现的。许多体内和体外研究表明，暴露于PFAS可增加COX2的产生或激活LOX介导的途径。氧化的 NAE 代谢物比它们的前体具有更多的抗炎特性。因此，DHA 和 NAE 的减少至少部分是全氟己烷磺酸引起的氧化损伤和炎症的结果。与之形成鲜明对比的是，在全氟己烷磺酸暴露后，随着浓度的增加，酰基肉碱表现出相反的效果。酰基肉碱在将脂肪酸转运到线粒体中以实现脂肪酸完全氧化的过程中是必不可少的。 酰基肉碱的上调与线粒体中不完全的脂肪酸 β-氧化 (FAO) 相关。有许多关于PFAS的体内和体外研究显示了FAO相关效应。一项关于 PFOA 对人类肝细胞毒性的研究也发现了类似的结果。 不利的是，由于细胞因子的激活和 COX-2 的表达，酰基肉碱水平的增加导致氧化应激和炎症。

甘油磷酯：在暴露于全氟己烷磺酸的胚胎中，大多数具有高不饱和度的乙醚 PC 的浓度从 48 hpf到 120 hpf降低。醚脂除了作为结构元素、信号分子和细胞分化调节器外，还被认为是抗氧化剂。结果表明，醚脂与中性粒细胞的正常发育和调节炎症有关，但确切的机制尚不清楚。与其他抗氧化剂（PUFAs 和 NAEs）不同，醚脂 在斑马鱼发育中的含量更高。在膜模型中使用合成醚脂 的研究表明，醚脂的抗氧化能力与两条脂肪酸链的不饱和度和长度有关。先前的一项研究表明，醚脂可以保护不饱和膜脂免受氧化损伤。

图4、PFHxS影响的脂质数量与发育阶段的不同有关

溶血磷脂酰胆碱 (LPC) 水平改变与疾病之间的相关性存在争议。 此前有报道称，LPCs 水平升高与促炎状态有关。LPCs 的稳态与 PC 和溶血磷脂酸 (LPA) 代谢密切相关。在相同阶段，除120 hpf条件下的1μM暴露外，暴露组和对照组之间的总PC含量没有显著差异。自噬毒素将LPC转化为LPA对斑马鱼胚胎的血管和神经发育以及左右不对称性调节至关重要。较高水平的 LPA 与慢性炎症性疾病有关。发现小鼠血清中氧化脂质的增加是由全氟己烷磺酸引起的。我们观察到 120 hpf 时全氟己烷磺酸升高了两种氧化磷脂，PG (18:0/20:3, O) 和 PE (O-18:0/18:2, O)，这表明发生了氧化损伤。

脂质参与抗氧化防御机制：PFHxS显著改变48 hpf到120 hpf含有多不饱和脂肪酸（sn2）的PCs和PEs的浓度。具体而言，含有PCs和PEs的ω-3多不饱和脂肪酸（sn2）浓度增加，而含有ω-6多不饱和脂肪酸（sn2）的大多数PCs和PEs浓度降低。PCs和PEs中的ω-3多不饱和脂肪酸主要包括二十碳五烯酸（EPA，20:5n-3）和DHA（22:6n-3），而ω-6多不饱和脂肪酸由肾上腺素酸（AdA，22:4）和AA（20:4n-6）组成。此外，更多的亚油酸（LA，18:2n-6））作为其他ω-6多不饱和脂肪酸的前体，被用作GPL的成分。含有多不饱和脂肪酸的GPL在氧化稳定性、促炎症和抗炎以及膜性质方面发挥着重要作用。据广泛报道，ω-3多不饱和脂肪酸，特别是EPA和DHA，在抗氧化作用中起着关键作用。对于抗炎特性，含有DHA的PCs对促炎过程中的酶有抑制作用。此外，含有多不饱和脂肪酸的GPL被水解成多不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸是合成生物活性介质的主要底物，这些生物活性介质含有ω3多不饱和脂肪酸衍生的抗炎物质和ω6多不饱和脂肪酸衍生的促炎物质。

结论：在这项研究中，在斑马鱼的发育过程中观察到脂质成分的变化。例如，在胚胎发生过程中，含有DHA的甘油磷脂浓度增加。此外，低至0.3μM 的PFHxS对脂质代谢产生不良影响与氧化应激和炎症有关。全氟己烷磺酸降低了如 PUFA、NAE 和醚脂具有抗氧化特性的脂类浓度，而酰基肉碱、鞘脂和氧化脂类的浓度增加。另一方面，发现随着 ω-3 PUFA 水平的增加，PC 和 PE 脂质的组成发生了重塑，而含有 PC 和 PE 的 ω-6 PUFA 则减少。 这可能是PFHxS毒性的潜在防御机制，可能与PPARs信号通路有关。

原文出自：Fibrous dysplasia animal models: A systematic review - ScienceDirect