目前，国内外较常用的AD实验性动物模型主要为大鼠、小鼠及猴，以低等啮齿鼠类的模型最为常见，运用最普遍。其中，大鼠以其低廉的价格、易操作性、易控性等优势获得了广大研究者的青睐，被大量运用于AD发病机制和药物治疗的研究，但是大鼠为低等啮齿类动物，用于模拟人类疾病无疑存在巨大差距，而且该类模型只能提供某一部分或某一时段疾病发生发展的状况，这些均是限制鼠类动物模型发展的瓶颈，无法突破。因此，研究者纷纷将目光转移到非人灵长类高级生物(nonhuman primates, NHP)，如恒河猴、食蟹猴、狒狒、松鼠猴等，NHP由于在进化上的特殊地位，与人类神经生物学特性最为相似，成为了老年医学特别是AD研究的理想实验动物模型。前期的研究显示，无论是自发模型还是诱发模型，NHP都较啮齿类更好地复制了AD的病变，而且NHP可以训练用于完成特定的与记忆有关的任务，用于评价认知能力、情绪行为等神经精神心理的变化，这也是啮齿类动物无法替代的。但是，由于猴类价格高昂，实验成本倍增，且实验操作难度较大，不易获得，因此NHP模型制作还不够完善，远远不能满足疾病研究的需求，因此，开发新的NHP动物模型就显得尤为重要。

树鼩(Tupaia belangeri, tree shrew)作为NHP家族成员中的一员，在分类学上属哺乳纲，有胎盘类，是一个独立的目，称为攀鼩目(Scandentia)。分布在热带和亚热带，如东南亚-印度恒河北部、缅甸、越南、泰国、马来西亚、印度尼西亚和菲律宾等地，以及我国云南、广西、广东和海南等地。树鼩体型小，繁殖快，易驯养和饲育，价格适中，新陈代谢比犬、鼠等动物更接近于人，与NHP其他成员一样，解剖结构也更近似于人，在医学生物学上的用途很多，受到许多学者的重视。树鼩已被应用于病毒、生殖、免疫和社会生物学的研究，而在神经系统研究中主要用于视神经损伤和脑缺血的研究。到目前为止，关于树鼩AD的报道仅有1篇，研究发现，树鼩的Aβ前体蛋白的一级序列与人类有98％的相似性。此外，树鼩Aβ氨基酸序列与人类是相同的。然而，免疫组织化学染色发现在7～8岁的树鼩脑中没有Aβ，说明Aβ的形成可能受多因素调节。由此可见，标准化树鼩阿尔茨海默病模型的建立尤为重要。本节主要介绍树鼩侧脑室注射 Aβ1-40阿尔茨海默病模型的建立及行为学评估。

一、实验动物及分组

成年雄性滇缅树鼩[8～12月龄，体重(140±10)g，昆明医科大学实验动物中心提供]，并按照阿拉巴马大学伯明翰分校实验动物管理和使用委员会(IACUC)协议进行动物的饲养和安乐死，且所有实验均在9：00～14：00进行。所有动物经洞板实验筛选合格后随机分为两组：侧脑室注射Aβ1-40组及侧脑室注射0.01mol/L PBS组(n=8)。

二、实验所需试剂及器材

1.试剂名称  速眠新Ⅱ，1.5ml/只；苏醒灵3号，2.0ml/只；戊巴比妥钠，25g/瓶；0.9％氯化钠注射液，50ml/瓶；Aβ1-40，A1075；PBS，1L/包；碘伏，500ml/瓶；青霉素，80万U/瓶。

2.器材名称  大鼠脑立体定位仪；婴儿理发器；牙科钻；计时器；自制洞板；智能恒温培养箱；不锈钢灭菌器；一次性注射器；一次性乳胶手套；帆布手套；微量进样器(10μl)。

三、侧脑室注射Aβ1-40

以速眠新Ⅱ(0.1ml/kg)及3％的戊巴比妥钠(0.2ml/kg)肌内注射麻醉已备动物，按无菌操作规程，常规备皮(用婴儿理发器剔除枕顶部毛发，并用碘伏进行消毒)。将已备皮的树鼩俯卧位固定于大鼠脑立体定位仪上，进行铺巾，切开皮肤。将已抽取Ag1-40的微量进样器固定于立体定位仪上，按矢状缝向右1mm，前囟后7mm进行侧脑室的定位。用牙科钻于上述坐标将颅骨钻开，以脑表面为起点，垂直进针5mm。匀速缓慢推注3μl Aβ1-40(1min)，退针1mm，停针2min，再推注3μl(1min)，退针1mm，停针3min，退针2mm，停针3min，全部退针，确定无颅内出血后，牙科泥封闭骨窗，缝合皮肤；局部碘伏消毒，肌内注射苏醒灵3号。并将动物置于37℃环境并观察其呼吸、体温等情况，待其苏醒后放回树鼩饲养笼，2h后喂水、喂食。

四、模型的评估

(一)改良的洞板实验

实验程序包括适应期、学习期、测试期3部分，每个阶段4d。①适应期：动物学会打开盖子去搜索面包虫，每天60min。②学习期：每天完成2个任务，每个任务包括3次实验，其中前2次用彩色胶带标记诱饵孔(视觉空间实验)，第3次实验去除标记(空间实验)。动物自愿到达洞板记为实验开始，动物搜索到4个孔的面包虫实验结束。每次实验间隔15min，3次实验的诱饵位置不变。间隔30min后，改变诱饵孔的位置，重复以上实验。③测试期为正式实验阶段，方法与学习期相同。动物打开无面包虫的孔判定为选择错误，动物对先前已打开的孔的访问为重复。记录选错次数、重复次数、到达洞板的时间、花在每个诱饵孔的时间。5min内不认洞板，或7min内未完成实验的为无效实验。

(二)组织的准备

以3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸、暴露心脏，经树鼩心尖朝主动脉方向插管，先用300ml生理盐水灌注，再用4％多聚甲醛300ml灌注固定。打开颅骨，取出大脑，放入4％多聚甲醛中固定4h，之后将组织浸入10％、20％和30％的蔗糖-PBS中梯度脱水并按常规程序做石蜡切片。

五、实验结果

(一)侧脑室定位

为了准确定位树鼩侧脑室，本实验采用可视的墨汁进行立体定位注射。结果显示，侧脑室注射后双侧胼胝体、海马和背侧丘脑等与侧脑室相邻部位均呈黑色(图15-4)。

(二)洞板实验

经过筛选，找到树鼩最喜好的食物，并随机选取了已经成功驯养的成年雄性树鼩7只进行洞板实验的检测，结果显示，训练后树鼩找完食物的时间比训练前短(P<0.05)，注射30d后Aβ1-40组找完食物的时间明显较PBS组长(P<0.05)(图15-5)。

六、注意事项

(1)树鼩是一种应激性极强的动物，所以每只动物需单独饲养，且在整个实验中一定要

固定饲养环境，不可随意更换。

(2)在实验前应对所有树鼩进行洞板实验的训练及测试，筛选出合格的动物进行实验分组，以确保实验的可靠性。

(3)在洞板实验过程中，用摄像头进行全程监控，工作人员不得在实验过程中进入动物饲养房，以免惊扰动物，影响实验结果。

(4)本实验采用速眠新Ⅱ及戊巴比妥钠复合麻醉，术后再注射苏醒灵3号(可对抗速眠新Ⅱ)，这样可以降低动物死亡率。

(5)开颅时仅将颅骨钻开，切记不要损伤脑组织。

(6)由于侧脑室容积一定，且脑脊液循环速度有限，因此侧脑室注射时一定要严格遵守进针/退针的深度及停针时间，并且在推注过程中一定要遵循匀速缓慢原则，否则可能导致动物死亡。

(7)术后腹腔注射青霉素预防感染，注射时使动物头部朝向地面倾斜45°，进针后回抽，见空气后方可按剂量进行注射。若出现血性或其他液体(可能是尿液)，则退针重新进行注射。