1、Q:利用crsipr敲除，可以用瞬转质粒嘛？

A:可以！这样做得到的细胞是mosaic，即有的细胞是基因组编辑了，有的则没有；有的细胞基因敲除了，有点则没有。如果只要改变部分细胞基因即可的话，则可以通过瞬转，如以原代细胞为研究对象。

2、Q:保存领到的质粒和菌液，说明书上说质粒保存温度-20℃/-80℃，怎么决定？我把领到的装质粒和菌液的离心管插到一个管插上直接放进-80℃冰箱可以吗？

A:在两个温度下都可以保存，但请注意，质粒可保存的时间较短（1～2年）。建议将相应的细菌加甘油，可在-80℃下长久保存。细菌需要加冷冻保护剂甘油才能冻存到-80℃冰箱中，质粒直接放入。

3、Q:我想把CRISPR-Cas9质粒的flag标签直接替换成GFP标签，是不是可以直接对FLAG标签附近的酶切位点进行双酶切就可以了？谢谢！

A:FLAG附近没有可以直接用于酶切的酶切位点。

4、Q:请问可以用cas9技术对腺病毒骨架质粒进行编辑吗？

A:可以。

Q:在真核细胞还是原核细胞里好改造？

A:多大的质粒？一般改造质粒在体外用常规的分子操作即可。

Q:转过质粒后用puro筛选细胞，细胞传了几代不怎么死了，请问是剩下的这些细胞都是转进了质粒呢还是传代对细胞有影响，还是相当于只用药筛了一个生长周期？

A:有可能是抗生素浓度过大造成的，如果质粒表达荧光蛋白可以镜检一下，不过传代次数多了荧光也会减弱。

5、Q:我这边用咱们的质粒做了个敲除实验，结果很不错，现在我对敲入很感兴趣，想问一下定点敲入的话，供体质粒怎么选择？

A:供体的设计取决于期望敲入DNA片段的情况。

6、Q:cas9质粒转染细胞后需要做CruiserTM酶筛选阳性克隆吗？是不是也需要确定一下基因敲除的效率约为多少呢？

A:我们建议的策略是直接测序，不建议酶切，因为直接测序结果更明确，性价比更高（可避免假阳性结果），对于酶切，我们没有成功经验。

7、Q:我想验证质粒是否已整合到基因组上，想设计一对puro的引物，然后去基因组上扩增，首先想拿质粒上的这段puro基因去NCBI中先比对一下，我是应该和pac基因的序列比对吗？

A:你所说的pac基因是什么意思？GenBank上应该可以找到puro的编码序列。上ncbi网页，将pcr产物的测序结果直接比对（BLAST）就可以。

Q:我拿质粒上的puro序列和puro的全序列进行了比对，发现在1650bp处的碱基发生了替换，这对puro的抗性会有影响吗

A:看看是否为同义突变？一般不会有问题。

8、Q:我想用Crispr构建一个基因敲除的慢病毒载体，在细胞里做loss of function，公司说评估了一下我们的基因，回复sgRNA评分很低，没办法三保一，我想问一下，在sgRNA评分低的情况下，这个基因还能不能做？

A:已有的软件给出的sgRNA活性评价都是基于有限的实验数据，对未知的sgRNA活性推测只能具有参考意义。鉴于慢病毒包装比较贵，而制备All-in-One的sgRNA表达质粒要便宜很多，因此建议首先在细胞系上（同物种，转染效率高）先进行sgRNA活性检测，以筛选到有活性的sgRNA。一旦筛选到有活性的sgRNA，未来只要包装一个有活性的sgRNA表达载体/Cas9表达载体的慢病毒即可。

9、Q:我想请教一个问题，我们用cas9工具慢病毒敲除一个A基因后，想再把带有一个突变位点的A基因（带有突变A基因的载体是质粒）插入基因组内，可以请教一下转染了慢病毒之后多久之后转染质粒，这个突变基因插入基因组内的成功率会比较高呢？

A:工作对象是原代细胞还是细胞系？

Q:细胞系。

A:那么质粒转染没有问题了。不过，有一个问题，含突变位点的A基因是否会被病毒携带的基因组编辑工具所识别，如果是，成功重组的表达质粒中的A基因会被基因组编辑工具所编辑，就有可能实现不了你的目标。敲除可以考虑直接用质粒瞬转，敲入使用慢病毒，这样更合理。

10、Q:是否能将sgRNA单链序列（20+60）和Cas9蛋白共同注射到靶细胞，然后检测编辑效果？

A:细胞系一般用质粒转染方式递送DNA形式基因组编辑工具、原代细胞用病毒转导递送DNA形式基因组编辑工具、受精卵用显微注射方式递送RNP形式基因组编辑工具。

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