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基于斑马鱼基因编辑的相关问题讨论
1.Q：老师您好，我粗略查阅了一些资料，发现用斑马鱼建立人类疾病模型由来已久，那么使用CRISPR/Cas9技术做这个工作想必是有全新的特色甚至创新。那么这里的特色和创新是什么呢？比如说，用基因编辑技术做这个工作，比之前不用基因编辑的时候，能做到什么新的事情，或者在性能上有什么突破性的提高呢？
A：1）在基因组编辑技术出现之前，斑马鱼无法进行靶向突变；
2）87%的人类基因在斑马鱼基因组中可以找到同源基因。基于进化的保守性，用斑马鱼模型可以模拟人类疾病，开展功能基因组学研究，探究关键基因在人类疾病发生中的作用与机制；
3）不同模式动物有不同的特点，斑马鱼模型的特征在于斑马鱼胚胎的体外受精、体外发育且发育速度快、胚胎透明（早期发育事件可在体外直接观测）；此外，斑马鱼个体较小，维护成本低，特别适合于小型实验室开展涉及发育生物学、遗传学、发育毒理学、环境毒理学、药物毒理学、候选药物筛选及生物学效应评价等不同领域的基础及应用研究。
2.Q：老师您好，我有个问题，斑马鱼注射时注射的是卵黄而不是胞质，卵黄的作用主要是提供营养，那么注射进去的mRNA或者DNA为什么也能被吸收入细胞质？
A：显微注射斑马鱼胚胎时，注射的位置是受精卵的动物极，具体位置为动物极侧的细胞质中，或者动物极细胞质与卵黄相交处，注射针一般与胚胎（动物极朝上）呈45度+角；当然，也有人将mRNA或DNA直接注射入卵黄，在这种情况下，如果注射的比较早的话，注射物是有机会进入到胚胎细胞中的，因为早期胚胎细胞卵裂是不均裂，仅细胞核分裂，而细胞质不分裂，至第4次分裂形成16-细胞期的胚胎仍是合胞体。
Q：赵老师，您好！我想请问一下我设计靶位点在286bp处，但是套峰却出现在140bp处，到200bp处测序又没有出现套峰，然后在520bp处又开始出现套峰一直到最后，请问我这是脱靶了吗？
A：请问，测序的对象是什么？混合细胞的PCR扩增产物测序结果？还是单克隆细胞系的PCR产物扩增的测序结果？
Q：总的来说，看上去不像是发生了基因组编辑。也不像是突靶的结果，好像是含非特异性扩增产物的结果，是混合的鱼卵的pcr扩增未纯化产物，测序公司给的测序的结果说是多位点套峰，可能是由碱基突变或插入、缺失引起，给的测序结果是成功-杂合。那请问赵老师，我是不是要重新在NCBI上设计引物会比较好？NCBI上设计的引物特异性比在Primer 上的好吗？
A：你是还处在sgRNA活性验证阶段？
Q：不是，是注射到斑马鱼的鱼卵里面了，提取鱼卵的DNA做PCR检测
A：不明白！你是要敲除斑马鱼基因？sgRNA活性过去已验证过了？
Q：是的，敲除斑马鱼的基因，活性之前没有验证过。
A：我们现在建议在验证sgRNA活性时，将部分PCR产物（扩增自注射了基因组编辑工具胚胎基因组DNA模板）直接送测序；同时将另一部分PCR产物做T-载体克隆，然后送20个阳性转化子直接测序，最后将两个结果互相比较；在很多情况下（基因组编辑效率较低的情况下），PCR产物直接测序，看不到明显的基因组编辑现象，需要通过T-载体克隆后再送测20个克隆才能得知基因组编辑效率；2）引物设计建议使用NCBI的PrimerBlast在线软件。
3.Q：赵老师您好！我最近基因敲除遇到一个问题，我野生型的斑马鱼测序的结果居然在靶位点附近出现套峰，是由于等位基因引起的吗？还是由于靶位点附近的成串重复序列导致测序结果滑动影响了测序的结果？如果是等位基因引起的是选择实际测得的序列设计靶位点是吗？
A：方便上传测序峰图吗？
Q：是因为前面的太多重复的序列影响的吗？
A：可以问下测序公司，据说重复序列是会影响测序，你还可以换个方向测，避开重复序列。Q：恩，那还有一个可能是有同为基因存在吗？
A：不好说，换个方向测测看,读一下序列，可以有助于判断。
Q：我比对了ensemble上的序列，发现我的序列缺失了6个碱基。
A：对的，这个峰图很清晰，可以直接读，有一个等位基因缺少6bp？gtgtgt？
Q：是的。
A：这个序列在外显子上吗？
Q：缺失的序列在内含子上
A：在内含子上，看起来不止俩种产物！不是漂亮的双峰！那很有可能来自两个不同等位基因。基因型鉴定（基因组DNA扩增）有可能避开这个区域吗？
Q：可能避开不了，因为很靠近靶位点的内含子只相差几十个碱基对。这种情况我需要重新设计靶位点吗？
A：就测序所示的5'至3'方向，你的crispr是在5'侧出现套峰之前的位置吗？
Q：缺失碱基后面的第26bp的地方是出现外显子序列，第44个bp的地方是我的靶位点
838bp。
A：那么，反向测序一个反应，应该能看到crispr。不过，还是建议基因组扩增片段短一些，例如400至500bp，如果反向测序顺利，应该无需更改crispr设计。
更多问题请加入南京尧顺禹生物科技有限公司基因编辑交流群，南京大学模式所赵庆顺教授会给与您专业的解答！
相关详情请登录本公司网站： www.njfish.cn 或联系电话 025-58603268
1.
Q：老师您好，我粗略查阅了一些资料，发现用斑马鱼建立人类疾病模型由来已久，那么使用CRISPR/Cas9技术做这个工作想必是有全新的特色甚至创新。那么这里的特色和创新是什么呢？比如说，用基因编辑技术做这个工作，比之前不用基因编辑的时候，能做到什么新的事情，或者在性能上有什么突破性的提高呢？
A：1）在基因组编辑技术出现之前，斑马鱼无法进行靶向突变；
2）87%的人类基因在斑马鱼基因组中可以找到同源基因。基于进化的保守性，用斑马鱼模型可以模拟人类疾病，开展功能基因组学研究，探究关键基因在人类疾病发生中的作用与机制；
3）不同模式动物有不同的特点，斑马鱼模型的特征在于斑马鱼胚胎的体外受精、体外发育且发育速度快、胚胎透明（早期发育事件可在体外直接观测）；此外，斑马鱼个体较小，维护成本低，特别适合于小型实验室开展涉及发育生物学、遗传学、发育毒理学、环境毒理学、药物毒理学、候选药物筛选及生物学效应评价等不同领域的基础及应用研究。
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Q：老师您好，我有个问题，斑马鱼注射时注射的是卵黄而不是胞质，卵黄的作用主要是提供营养，那么注射进去的mRNA或者DNA为什么也能被吸收入细胞质？
A：显微注射斑马鱼胚胎时，注射的位置是受精卵的动物极，具体位置为动物极侧的细胞质中，或者动物极细胞质与卵黄相交处，注射针一般与胚胎（动物极朝上）呈45度+角；当然，也有人将mRNA或DNA直接注射入卵黄，在这种情况下，如果注射的比较早的话，注射物是有机会进入到胚胎细胞中的，因为早期胚胎细胞卵裂是不均裂，仅细胞核分裂，而细胞质不分裂，至第4次分裂形成16-细胞期的胚胎仍是合胞体。
Q：赵老师，您好！我想请问一下我设计靶位点在286bp处，但是套峰却出现在140bp处，到200bp处测序又没有出现套峰，然后在520bp处又开始出现套峰一直到最后，请问我这是脱靶了吗？
A：请问，测序的对象是什么？混合细胞的PCR扩增产物测序结果？还是单克隆细胞系的PCR产物扩增的测序结果？
Q：总的来说，看上去不像是发生了基因组编辑。也不像是突靶的结果，好像是含非特异性扩增产物的结果，是混合的鱼卵的pcr扩增未纯化产物，测序公司给的测序的结果说是多位点套峰，可能是由碱基突变或插入、缺失引起，给的测序结果是成功-杂合。那请问赵老师，我是不是要重新在NCBI上设计引物会比较好？NCBI上设计的引物特异性比在Primer 上的好吗？
A：你是还处在sgRNA活性验证阶段？
Q：不是，是注射到斑马鱼的鱼卵里面了，提取鱼卵的DNA做PCR检测
A：不明白！你是要敲除斑马鱼基因？sgRNA活性过去已验证过了？
Q：是的，敲除斑马鱼的基因，活性之前没有验证过。
A：我们现在建议在验证sgRNA活性时，将部分PCR产物（扩增自注射了基因组编辑工具胚胎基因组DNA模板）直接送测序；同时将另一部分PCR产物做T-载体克隆，然后送20个阳性转化子直接测序，最后将两个结果互相比较；在很多情况下（基因组编辑效率较低的情况下），PCR产物直接测序，看不到明显的基因组编辑现象，需要通过T-载体克隆后再送测20个克隆才能得知基因组编辑效率；2）引物设计建议使用NCBI的PrimerBlast在线软件。
3.
Q：赵老师您好！我最近基因敲除遇到一个问题，我野生型的斑马鱼测序的结果居然在靶位点附近出现套峰，是由于等位基因引起的吗？还是由于靶位点附近的成串重复序列导致测序结果滑动影响了测序的结果？如果是等位基因引起的是选择实际测得的序列设计靶位点是吗？
A：方便上传测序峰图吗？
Q：是因为前面的太多重复的序列影响的吗？
A：可以问下测序公司，据说重复序列是会影响测序，你还可以换个方向测，避开重复序列。Q：恩，那还有一个可能是有同为基因存在吗？
A：不好说，换个方向测测看,读一下序列，可以有助于判断。
Q：我比对了ensemble上的序列，发现我的序列缺失了6个碱基。
A：对的，这个峰图很清晰，可以直接读，有一个等位基因缺少6bp？gtgtgt？
Q：是的。
A：这个序列在外显子上吗？
Q：缺失的序列在内含子上
A：在内含子上，看起来不止俩种产物！不是漂亮的双峰！那很有可能来自两个不同等位基因。基因型鉴定（基因组DNA扩增）有可能避开这个区域吗？
Q：可能避开不了，因为很靠近靶位点的内含子只相差几十个碱基对。这种情况我需要重新设计靶位点吗？
A：就测序所示的5'至3'方向，你的crispr是在5'侧出现套峰之前的位置吗？
Q：缺失碱基后面的第26bp的地方是出现外显子序列，第44个bp的地方是我的靶位点
838bp。
A：那么，反向测序一个反应，应该能看到crispr。不过，还是建议基因组扩增片段短一些，例如400至500bp，如果反向测序顺利，应该无需更改crispr设计。
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