脑脊液可通过脊髓腔穿刺法采集，小动物也可通过枕骨大孔直接采集。

兔脑脊液的采集通常采取脊髓穿刺法：穿刺部位在两髂连线中点稍下方第7腰椎间隙。动物轻度麻醉后，侧卧位固定，使头部及尾部向腰部尽量屈曲，剪去第7腰椎周围的被毛。消毒后操作者在动物背部用左手拇、示指固定穿刺部位的皮肤，右手持腰穿刺针直刺入，当有落空感及动物的后肢跳动时，表明针已达椎管内(蛛网膜下腔)，抽去针芯，即见脑脊液流出。如果无脑脊液流出，可能是没有刺破蛛网膜。轻轻调节进针的方向及角度，如果脑脊液流得太快，插入针芯稍加阻塞，以免导致颅内压突然下降而形成脑疝。

大鼠脑脊液的采集可采用枕骨大孔直接穿刺法：大鼠麻醉后，头部固定于定向仪上。头颈部剪毛、消毒，用手术刀沿纵轴切一纵行切口(约2cm)，用剪刀钝性分离颈部背侧肌肉。为避免出血，最深层附着在骨上的肌肉用手术刀背刮开，暴露出枕骨大孔。由枕骨大孔进针直接抽取脑脊液。抽取完毕缝好外层肌肉、皮肤。刀口处可撒些磺胺药粉，防止感染。采完脑脊液后，应注入等量的消毒生理盐水，以保持原来脑脊髓腔里的压力。