1．实验方法  选择4～6月龄的实验用小型猪，麻醉状态下拔除小型猪乳下切牙，无菌条件下劈开取牙髓，将牙髓组织剪成约1mm3的小块，经酶消化，置于高糖DMEM培养基中培养。

(1)单克隆细胞挑选：取第3代细胞，以每毫升50～100个的细胞密度接种于24孔板中，常规培养10天，挑选>50个细胞的克隆。用滤纸片法转移至新的24孔板中，细胞融合后移入6孔板中，扩大培养至2×10⁵个。

(2)免疫荧光染色鉴定：取15个单克隆细胞，接种于24孔板中，每孔2×10⁴个，加入高糖DMEM培养基，5％CO₂，37℃培养24小时，4％多聚甲醛0.5ml固定，每孔加0.3％Triton100 0.5ml室温作用5分钟，再加10％封闭用正常羊血清0.5ml室温作用60分钟；弃封闭液，每孔分别加1：200小鼠抗人nestin抗体、1：600小鼠抗人β-tubulin-Ⅲ抗体、1：500小鼠抗猪Vimentin抗体、1：200小鼠抗人STRO-1抗体0.2ml，4℃过夜。吸弃一抗，PBS冲洗3次。每孔加二抗0.2 ml，37℃孵育30分钟，荧光显微镜观察并摄影。

(3)诱导分化实验分组：挑选STRO-1表达阳性的单克隆细胞，诱导A组：单克隆来源细胞组；诱导B组：混合细胞来源组；对照A组：单克隆来源细胞组；对照B组：混合细胞来源组。

2．培养结果

(1)小型猪乳牙牙髓细胞形态学特征：倒置显微镜下观察，细胞形态呈多样性，梭形细胞及多角形细胞呈片状生长，胞体丰满，胞浆均匀，细胞核圆，核仁清晰。神经样细胞呈放射状、草丛状生长，胞体较小，胞浆透亮。随着细胞传代，神经样细胞消失，主要呈梭形或多角形细胞。

(2)单克隆小型猪乳牙牙髓细胞形态学特征及免疫荧光染色鉴定结果：小型猪乳牙牙髓细胞低密度接种，克隆集落形成率2.74％，克隆集落细胞呈多角形，免疫荧光染色鉴定，15个单克隆细胞中有6个表达血管周细胞表面标志及骨髓基质祖细胞标志STRO-1阳性，阳性率约76.4％。镜下观察到表达STRO-1强阳性的细胞为多角形细胞，少数梭形细胞表达STRO-1弱阳性。波形丝蛋白是间充质来源细胞典型表征，检测结果为15个单克隆细胞均表达波形丝蛋白阳性。15个单克隆小型猪乳牙牙髓细胞均表达神经元细胞特异性抗体nestin，阳性率约69.7％。

(3)矿化诱导结果：小型猪乳牙牙髓细胞在矿化液的诱导下，体外培养4周Von kossa染色，6个单克隆来源的诱导组A均呈现较多明显密集的黑色阳性反应区域，碱性磷酸酶表达明显，呈现红染的阳性区域。诱导B组与诱导A组无明显差异，对照A组和对照B组只有少量散在矿化点和红染区域。碱性磷酸酶定量检测结果显示诱导A组和诱导B组与对照A组和对照B组碱性磷酸酶活性有明显差异，诱导A组与诱导B组间无明显差异。

(4)脂肪诱导结果：经过IBMX、消炎痛和氢化可的松诱导，诱导A、B组中均有部分细胞漂浮。3周小型猪乳牙牙髓干细胞可诱导成脂肪细胞，脂滴在相差显微镜下为圆形，有明显的折光。随诱导时间的延长，胞浆内的脂滴逐渐增多、聚集、增大，排列成葡萄串状。6个单克隆来源的诱导A组有4个孔经油红染色可见细胞内橙红色阳性颗粒，脂肪诱导的阳性率较低，4倍光镜下计算20个视野内出现脂滴细胞约占5％。6个混合来源的诱导B组有2个孔有极少量油红染色阳性出现，对照组细胞内无橙红色阳性颗粒，油红染色阴性。

(5)神经元细胞诱导结果：6个单克隆来源的诱导A组有2个孔的细胞形态发生明显变化，原大而扁平的胞体发生收缩，细胞边缘变得不规整，有许多细的指状突起。诱导2周后，细胞发生明显的形态学变化，细胞胞体进一步收缩，形成圆形、不规整的锥形、三角形，有的细胞有多个突起，且有分支，终末端有类似神经元细胞的终结。诱导后免疫荧光染色结果为β-tubulin-Ⅲ抗体阳性，STRO-1抗体染色阴性，从细胞形态及免疫荧光染色结果分析，乳牙牙髓干细胞已向神经细胞分化。诱导B组及对照A、B组无明显神经元样细胞出现。