摘要：麻醉诱导的大脑神经毒性研究的发展，必须依靠一个无懈可击的动物模型和标准化的处理方法。这种方法可以识别作用机制。本研究的目的是开发一种新的，临床上相关的，转化方式使用一个小猪模型来探讨麻醉剂对大脑发育的影响。

 

 

综述：每年，数以百万计的儿童接受全身麻醉。异氟烷，GABAA型受体激动剂（GABAA），是一种吸入麻醉常用于儿科临床麻醉实践。传统上认为，只要是避免严重低血压和缺氧，麻醉是安全的。在脑发育中干扰兴奋性和抑制性神经递质平衡可能诱发炎症反应和改变正常的突触连接和树枝状树突的形成。这些变化在大脑发育的关键时刻可能会导致过度的细胞损失，随后导致显著性认知功能障碍。关于异氟烷和其他儿科使用的麻醉剂引发神经毒性的报道引发了对麻醉剂安全性的重大关注，特别是婴幼儿。

 

当代儿科麻醉面临阐明常用麻醉药对发育中的大脑潜在的神经毒性作用的迫切需要。最近在英国医学杂志上发表的一封信，引起了孩子们对麻醉诱导的神经毒性的重大关注，并加强了对这些指控的真实含义的识别。

 

为了保证婴幼儿和儿童进行必要的手术和全身的安全麻醉，它已成为小儿麻醉界的当务之急。

 

选择小型猪模型的理由：需要一个现成的，可重复的和可转化的动物模型，尽可能密切适用于人类的新生儿，允许在研究麻醉剂对脑发展的影响。啮齿类动物和灵长类动物模型，用于之前大多数的研究，研究麻醉神经炎症/神经毒性不是理想的动物模型因为其数量原因。啮齿类动物是优秀的模型来研究神经病理学机制，但结果的翻译对人类始终是一个相当大的挑战。虽然非人类灵长类动物是麻醉剂诱导神经毒性研究的优秀的模型，只有几个小儿麻醉毒性研究使用这一模型。此外，使用非人类灵长类动物有几个局限，阻碍了其广泛的实施，如成本和处理难度。近年来，小型猪已经成为一个公认的替代性较大的神经科学研究动物模型。他们已被用来研究各种儿科疾病，包括神经炎症情况下（脑外伤感染、脑中风、外伤性脑损伤、癫痫）。这也许是因为人类和猪中枢神经系统同源性的结果。种间相似始于胚胎发育。与人类相比，猪神经发育的时间较短，与人类大脑的发育有惊人的相似。猪神经管闭合，性别发展，胶质细胞分化，和神经递质的构造也类似。

 

胎儿后期，将人脑同猪脑相比，在神经解剖学和神经生理学方面有诸多类似。小型猪比其他哺乳动物有更多的与人类中枢神经系统的相似性。例如，人类和猪是唯一已知的哺乳动物物种有大脑的"井喷式增长"穿越围生期，伴随从产前到产后的快速发展期。此外，猪和人类之间共享许多大体解剖，包括脑回、灰质和白质特征及分布。相关的动物模型必须在人类病理学的背景下理解，特别是在关系到大脑的成熟和人类婴儿的病理学。在非人灵长类动物的情况下，极少数神经递质受体的基因已被克隆，这意味着关键的受体配体的亲和力，变构调节剂，翻译后修饰，剪接变异体，和受体亚基组成，所有相关的麻醉介导相关的神经损伤，这个物种是未知的。

 

另一方面，猪的GABA A受体和NMDA受体被克隆。与新生鼠相比，在仔猪出生时的成人脑重量的百分比更接近人类。猪的大脑更类似人的大脑，是多脑回动物，而啮齿类动物是无脑回的。新生儿猪颅骨的几何形状和皮质和基底节的拓扑结构跟人类婴儿类似。猪和人类的重要的相似性也在海马，基底节和脑干被证明，这肯定是我们感兴趣的研究领域。猪与人的大脑在生长模式相似。同非人灵长类动物或啮齿类动物的大脑产前与产后增长相比，仔猪大脑发育更类似于足月妊娠的人类新生儿。发育猪脑的多层皮质亚盘和晕眩的表达模式，一种影响神经细胞迁移的糖蛋白，强烈的类似于人类大脑的发展。人类新生儿和仔猪灰质和白质的分布和模式相似，和出生后的猪大脑的成熟可与对人的髓鞘形成和电活动相媲美。另一个重要的考虑因素是断奶仔猪和人类婴儿的大脑发育的时间差异。10～14日龄仔猪显示大脑快速生长，神经元成熟，和突触连接与两个月大的婴儿大脑类似。也许最重要的是，人类和猪的基因组之间存在着令人印象深刻的同源性，这两个物种中的许多基因都是保守的一个更合适的预临床模型通过研究麻醉剂对新生儿大脑诱导的神经毒性对临床有一个明确的指示。麻醉诱导的脑细胞结构的变化为适用性仔猪模型的神经毒性的研究提供了证据。

 

这个研究需要一个"积极控制"是显而易见的，因为很少有关于猪神经发炎的外观和表现。炎症是一种潜在的使用麻醉后引起的损伤机制。LPS组用来测试是否急性炎症反应可引起仔猪的脑细胞结构的重大变化和代表基准同动物接受异氟醚相比较。脂多糖在革兰阴性菌的外膜被发现。这些分子动物免疫原性强，有能力产生一个强大的炎症反应。全身急性期反应仔猪表现为发热、嗜睡、呼吸急促和腹泻。很明显，外周炎症刺激导致神经炎症反应，可通过小胶质细胞的激活和中枢神经系统细胞因子的升高来证明。

 

 

动物：选用健康的10-14日龄，体重2-4kg的猪。动物有24h的环境适应时间。动物被随机分为三个研究组：（1）对照组（10）；（2）脂多糖（阳性对照组，9）；（3）异氟烷麻醉（10）。

 

对照组动物：对照组动物没有接受任何类型的干预实验。48小时后，100%氧气含8%七氟烷通过面罩法对猪进行麻醉。七氟烷用于诱导，以尽可能地模仿人类的程序。这个过程被用于所有的实验组。适当的麻醉深度通过爪捏反射消失确认。使用市售的蠕动泵执行心脏灌注。灌流液中由冷（4°C）磷酸盐缓冲液（PBS）含肝素（5 U／ml）组成。最初5分钟，该灌流溶液用300毫升/分钟，后直到液体清晰。一旦PBS灌注完成，移除大脑半球的骨瓣对新鲜组织进行分析。在此过程中，冰PBS循环持续在50毫升/小时的速率，以保证大脑保持冰冷。当取半球时，应注意防止半球的血液供应中断。半球被冷冻和储存在?80°C冰箱以备后来分析。在半球切除后、灌流液改为4%多聚甲醛（PFA）。PFA灌注持续在300毫升/分钟，至少5分钟。组织固定至少持续一夜用4°C.4% PFA。24小时后，固定的大脑搬到含0.1%叠氮钠的PBS溶液。组织储存在4°C最长1个月。

 

炎症控制动物：LPS腹腔注射，剂量为100微克/公斤。给药后，皮肤的温度使用液体结晶条温度计贴于皮肤被连续监测。使用脂多糖后，动物由经验丰富的工作人员在第一个6小时至少一小时被观察一次。仔猪使用LPS后最常见的表现为体温升高、呼吸急促，食欲不振，呕吐和腹泻。不再给予麻醉剂和抗发炎药物。

 

异氟烷麻醉：本研究的主要目标是制定一个标准化的方法，对一个复杂的动物模型麻醉，随着消除缺氧、高碳酸血症、电解质异常的目的，或其他生理混杂因素的影响。经过24小时的驯化期，在100%个氧气中含8%七氟烷通过面罩法麻醉。这重现了用于婴儿和儿童麻醉诱导的技术。此外，七氟醚的使用导致动物更快的诱导麻醉和较低喉的痉挛风险。

 

在诱导期和研究过程中的所有时间连续监测脉搏血氧饱和度、无创血压、心电图的。诱导后，停止七氟醚和异氟醚浓度允许充分的麻醉深度，允许持续的自主呼吸。由于其良好的安全性和较低的成本在世界范围内广泛使用，异氟烷用于维持麻醉。24号静脉导管放置在耳缘静脉注入5%葡萄糖溶液，即4倍的仔猪体重毫升/小时，使用头孢唑啉，25毫克/公斤，预切口预防手术部位感染。

 

手术结束时，股动脉导管取出，伤口注射0.25%布比卡因1毫升/公斤，与1:200000肾上腺素来控制疼痛和模拟人的管理。麻醉停止，在气管拔管时允许唤醒仔猪。丁丙诺啡0.05毫克/公斤皮下注射，每3小时需要确保适当的疼痛控制。在适当的时候，小猪被送回它的家笼子，积极地用暖光加热。动物恢复为48小时。手术后，第一个6小时每小时对他们进行了监测，其后每4小时监测。监测包括一般的观察，体温，手术部位的检查和呼吸速率的测量。如果动物是清醒的，行为正常情况下，生命体征如血压没有测量，由于仔猪清醒情况下难以获得非侵入性的血压。

 

这项研究是第一个新的使用的临床相关的新生仔猪模型的研究，对发育中的大脑的麻醉效果。它首次报道了在暴露于异氟烷麻醉时，内皮祖细胞分布的变化。我们发现，临床相关的异氟醚吸入麻醉诱导剂，对大脑学习和记忆的关键区域的神经胶质细胞聚集明显。此外，我们报告发现一个有关动物暴露于异氟烷后基底节缺血性中风    一个重要的发现是，异氟醚和LPS诱导导致内嗅皮质祖细胞形成的"集群"明显增加。这些祖细胞可以分化为胶质细胞，少突胶质细胞、星形胶质细胞或神经元。LPS诱导的炎症反应是众所周知的，小胶质细胞和中枢神经系统的细胞因子升高激活。因此，一种可能的情况是，如LPS异氟醚可诱导仔猪祖细胞分布的变化，通过激活炎症反应机制。