要确定是否能实现经批准人使用的对幽门螺杆菌的全身免疫接种。与幽门螺杆菌抗原与氢氧化铝结合（AlOH3）疫苗的疗效是在一个小鼠感染幽门螺杆菌模型上进行评价的。抗原和-AlOH3免疫能诱导白介素-5分泌、抗原特异性T细胞，免疫抗原。完全弗氏佐剂诱导II型干扰素分泌、抗原特异性T细胞，通过ELISPOT测定。遇幽门螺杆菌后，两种免疫应答的保护，由于完全没有任何细菌的证实，通过两个组织学胃活检标本的培养来评估的。保护机制有抗体独立性，用抗体缺乏MMT小鼠（免疫球蛋白基因敲除小鼠）和来自免疫小鼠的CD4 +脾T细胞足以转移保护性免疫到免疫缺陷接受处。这个结果表明有替代或是有潜在更多的策略来迅速发展幽门螺杆菌疫苗。

 

幽门螺杆菌，是世界上最常见的病原体，是一种细胞外细菌感染胃粘膜引起胃炎和消化性溃疡病。一般认为，感染主要见于年幼的孩子。因此，预防性疫苗使用可能使婴儿避免幽门螺旋杆菌感染和长时间成年人的疫苗保护，疫苗的接种策略主要是经口和鼻腔来诱导黏膜免疫。这些免疫接种需要细菌外毒素佐剂在人类中使用是不安全的。全身免疫最近被报道作为一种可能的诱导保护小鼠幽门螺旋杆菌的免疫手段。作者推进这一想法， Th1型免疫反应的贡献，幽门螺杆菌相关的反应-相关胃癌病理的，是诱导免疫所必需的。这个建议是基于免疫球蛋白（IgG）类分析，没有对细胞因子进行直接测量。因为有几份报告已经证实这个保护可能是由2型免疫介导的。我们使用肠外免疫接种佐剂调查这一个更直接的方式，用ELISPOT法检测，产生高极化Th1或Th2反应。在本研究中，我们调查是否用氢氧化铝佐剂全身免疫（AlOH3）可诱导在没有抗体介导的保护性Th2 CD4 T细胞免疫。AlOH3诱导免疫会对幽门螺旋杆菌疫苗的研制有一个显著的优势。因为AlOH3已经被批准用于人类。它的安全性、稳定性和低成本能加快人类幽门螺杆菌的大规模发展应用。

 

材料和方法：小鼠  小鼠购买于杰克逊实验室并在无特定病原体条件下饲养。使用的小鼠是C57BL / 6或C57BL /6J-Rag1tm1Mom (rag1 / )，缺乏成熟的T和B淋巴细胞，或C57BL/6-Igh-6tm1Cgn (mMT)，缺乏成熟的B细胞，总之他们不能产生抗体。

 

细菌  H. felis是本实验室从猫胃活检标本中分离的。幽门螺杆菌菌株HPM6分离于人类胃活检标本，并在我们的实验室通过长期在小鼠体内传代的进行了调整。通过PCR检测cagA阳性来确定HpM6。用HpM6接种C57BL/6小鼠，会导致慢性感染，并在100%感染的小鼠中持续12个月。两螺杆菌通过菌落形态、菌体形态、革兰氏染色、脲酶、过氧化氢酶、氧化酶等方面对两螺杆菌进行了鉴定。

细菌生长在固体培养基（血琼脂培养基）和悬浮在布氏肉汤培养基。

 

小鼠免疫和途径：幽门螺杆菌裂解液，我们和其他人已经证明这是一种有效的实验疫苗抗原，通过口服途径。卵清蛋白（OVA）是从西格玛化工有限公司购买、AlOH3购自皮尔斯。和完全弗氏佐剂（CFA）是通过混合结核分枝杆菌H37RA（Difco实验室）按照1mg/mL到不完全弗氏佐剂制成的。抗原与佐剂在水溶液中按照1:1混合，100毫克的抗原与100毫升注射乳剂在第0天对每只小鼠腹腔注射。在第28天，用0.5mL含1×107 cfu细菌的肉汤培养基通过18号针通过胃插管灌胃给予。细菌数量的确定，通过使用先前建立的增长曲线设定光密度在450纳米的来计算得出。H. felis作为分离株难以增长繁殖，我们使用基于幽门螺杆菌生长曲线的标准吸收值来确定，如其他文献描述一样。

 

疫苗效价的确定：28天后，通过组织银染法来确定小鼠感染幽门螺杆菌。动物通过二氧化碳法安乐死。一个狭长的组织从十二直肠到贲门通过手术切除。组织通过10%甲醛缓冲液固定，后进行组织学检查。每个小鼠样品的几部分通过银染法染色，通过细菌的位置和形态来促进幽门螺杆菌和H.felis的鉴定。通过银染法，在组织中完全没有发现幽门螺杆菌才能确定小鼠是有免疫保护的。此外，从感染幽门螺旋杆菌的小鼠进行胃活检标本培养来确认存在或不存在细菌。含有幽门螺旋杆菌的样品是从胃窦部位手术切除，并同200mL肉汤培养基混匀。匀浆涂布在100mL含7%马血培养基。通过96微氧培养后，免疫保护的确定是通过被免疫的小鼠样品没有培养出细菌来确定的。当存在细菌时，幽门螺旋杆菌的菌落形态，革兰染色和脲酶、过氧化氢酶和氧化酶的产生来确定细菌。H. felis的培养是不可操作的，因为，培养不可靠，H. felis是呈片生长的，而不是独立生长。

 

病理学评价：同其他文献一样，对小鼠胃大弯的纵切面进行炎症强度评估。部分包括两者的胃窦和胃底粘膜腺体的整个长度。胃窦炎症分级是0-3，胃底炎症分级是1-10.每只老鼠的总体评分是按照一个线性范围来确定（焦点，多焦，斑片状或弥漫性）深度（浅表和/或基底，panmucosal，或延伸到粘膜下层或肌层）及炎性浸润的特征，按浸润细胞类型组织结构变化来定义。

 

过继转移：用小鼠T细胞CD4亚群柱试剂盒纯化CD4 T细胞，一千万的细胞通过尾静脉的方法注入到小鼠体内。这个数量是已经建立好的，和习惯用于自身免疫领域的研究。

 

酶联免疫斑点测定法（ELISPOT） 从脾制备单细胞悬浮液。1×106细胞被铺在带或不带幽门螺杆菌抗原每孔含有1 mM谷氨酰胺的无血清HL-1培养基。在最终浓度为5毫克/毫升。这些培养物被加到分别用特异性捕获干扰素或白细胞介素-5，R46-A2 (4 mg/mL)或TRFK5 (5 mg/mL)的PBS孵化的酶联免疫斑点板。在室温条件下，用含1%小牛血清白蛋白的pbs进行阻断1h，在开始24h细胞培养之前用PBS洗脱4次。然后，通过洗脱法去除细胞，通过添加1 mg/mL XMG1.2-HRP 为 IFN-g 或4 mg/mL TRFK4 为IL-5来监测抗体，平板孵化过液。对于IL-5再添加抗IgG2a-HRP，并继续孵化2h。通过添加3-amino-9-ethyl-carbazole可以看到平板中的抗体。为了评估结果，我们使用了系列1免疫斑点图像分析仪。

 

统计分析：实验组之间的ELISPOT的分析是通过方差分析来确定得。通过Fisher's的精确检验来对免疫后小鼠评估感染或不感染。

 

结果：幽门螺杆菌感染与免疫的小鼠模型是使用人类的病原体或是从猫科动物分离出的H. felis。用C57BL/6小鼠，不同于幽门螺旋杆菌，H.felis诱导小鼠产生胃黏膜的炎症性病变，类似人类胃炎。此外，依据小鼠胃组织学切片，H.felis产生较重的感染。不同于幽门螺旋杆菌，它的主要位于胃底交界处。主要是在胃窦部和胃底生长繁殖。我们使用H. felis或幽门螺旋杆菌 抗原同氢氧化铝AlOH3 or 完全弗氏佐剂CFA乳化剂对C57BL/6小鼠进行免疫。我们最近的研究表明这些佐剂能诱导2和1型免疫反应。十四天后，这些小鼠的脾细胞进行了测试幽门螺杆菌抗原特异性免疫反应，通过测量1型和2型细胞因子（分别为IFN-γ、IL-5）用酶联免疫斑点测定法（ELISPOT）。用抗原和氢氧化铝乳化后免疫的小鼠细胞能产生IL-5，缺乏IFN-r.产生IL-5的细胞数目比产生抗原特异性的IFN-r的数目多，两者都是通过幽门螺旋杆菌抗原免疫。相反的细胞因子数目在使用抗原和完全弗氏佐剂组中免疫后观察到，即IFN-r多。此外，用完全弗氏佐剂CFA免疫的小鼠血清中还有较高的IgG2a抗体滴度。在产生的各因子的相对数量细胞与这些抗体亚型分布免疫反应的基础上，对抗原乳化剂而言，用氢氧化铝诱导产生的2型免疫反应，完全弗氏佐剂激起的是1型免疫反应。然后我们测试是否2型或1型幽门螺杆菌抗原免疫诱导会对肠粘膜应对幽门螺杆菌感染起保护作用。用氢氧化铝或完全弗氏佐剂同幽门螺杆菌或H.felis乳化后对C57BL/6小鼠免疫。对照组小鼠用注射佐剂含有一个不相干的对照蛋白、卵白蛋白，或保持未经免疫的。在28天和28天后，通过灌胃法口服1×107幽门螺杆菌.后通过胃黏膜银染法来直观评价细菌数目。幽门螺杆菌存在或不存在是通过细菌培养法来确定的。这个免疫完全的小鼠研究无论那种佐剂都能起到很好的保护作用。通过观察银染组织中完全没有幽门螺杆菌。

 

虽然，14只对照小鼠中有12只感染幽门螺杆菌。8只小鼠中有7只注射幽门螺旋杆菌。注射氢氧化铝均无感染。使用佐剂氢氧化铝和完全弗氏佐剂后产生的保护作用是很重要的。小鼠体内H. felis比幽门螺杆菌有更严重的感染。29只小鼠中有28只感染，并在胃部有很强的细菌黏附。每个胃部有平均86个受感染腺体。没有细菌在使用H. feli抗原氢氧化铝佐剂的小鼠上发现。用完全弗氏佐剂和幽门螺杆菌的乳化剂也有保护作用（21只动物有5只感染）。我们研究及其他研究发现粘膜有效接种策略要求霍乱毒素跟佐剂一起被使用接种，我们使用氢氧化铝和完全弗氏佐剂同抗原一起使用也是参照粘膜有效接种策略的，同大量感染细菌的假性免疫小鼠机完全弗氏佐剂同H. felis乳化免疫后少量感染相比，氢氧化铝同H. felis乳化后免疫小鼠未发现有细菌感染。1型或2型免疫的诱导，是抗幽门螺杆菌粘膜免疫的一种可替代方案。小鼠切片后HE染色发现H. felis同氢氧化铝或完全弗氏佐剂免疫后小鼠在胃窦和胃底粘膜处都产生了等效的黏膜炎症。炎症的程度幽门螺杆菌抗原免疫后引起的炎症特征和程度同我们之前研究的霍乱毒素佐剂免疫后炎症特征和程度没有明显差异。小鼠使用氢氧化铝和弗氏完全佐剂同幽门螺杆菌抗原免疫小鼠平均胃底炎症分别是7.2 +0.9、 7.4  + 0.7。使用氢氧化铝和弗氏完全佐剂同幽门螺杆菌抗原免疫小鼠平均胃窦炎症分别是2.0 + 0、2.1 +0.6 。在所有的案例中，幽门螺杆菌抗原免疫小鼠有严重的炎症程度比使用卵白蛋白免疫的小鼠。这种免疫后的胃炎在其他实验中也观察到。很可能是由于抗幽门螺杆菌免疫记忆二次免疫导致的。

 

接下来，我们开始调查免疫后抗幽门螺杆菌的免疫机制。因为完全弗氏佐剂像霍乱毒素一样，是高度有毒，是不使用于人的。我们重点关注使用氢氧化铝佐剂。在随后的实验中，我们使用了小鼠-H. felis模型。因为这种微生物在小鼠上表现出更多的明显的炎症比幽门螺旋杆菌也导致较重的感染，通过组织学切片能很容易观察到。我们用氢氧化铝AlOH3，或卵白蛋白同H. felis抗原免疫小鼠同源uMT（免疫球蛋白基因敲除小鼠）。是否注射免疫后，能提供起保护作用的抗体。所有的8只免疫球蛋白基因敲除小鼠uMT使用卵白蛋白对照组在灌胃H. felis后均感染细菌，并有较高的细菌繁殖。然而，仅有一只使用氢氧化铝佐剂H. felis的免疫球蛋白基因敲除小鼠uMT，显示，有较强的免疫保护作用。完全免疫的B6小鼠，这些炎症反应没有明显不同。用氢氧化铝和H. felis免疫后导致胃窦炎症7.8 + 0.6，胃底炎症2.38+0.5。用卵白蛋白和氢氧化铝免疫后导致的胃窦炎症和胃底炎症分别为3.7+1.5、1.5+0.5.这与我们之前使用口服免疫免疫球蛋白基因敲除小鼠uMT的结果一致。

 

因为这些实验表明，注射疫苗后是不需要抗体免疫。接下来我们进行了一个实验来确定是否从注射过疫苗的小鼠纯化T细胞可以起过继转移保护。从免疫H.felis同氢氧化铝、卵白蛋白同氢氧化铝、H.felis同完全弗氏佐剂、卵白蛋白同弗氏完全佐剂免疫后28天的C57BL/6小鼠脾细胞中通过亲和柱纯化CD4 T细胞。

 

讨论：总之，已经证明，使用氢氧化铝AlOH3作为佐剂全身免疫可诱导产生保护性抗幽门螺杆菌和H. felis的老鼠，是介导CD42型细胞免疫。这些发现可能对一种用于人类的幽门螺杆菌疫苗的研有直接影响制。首先也是最重要的是，本报告加强了系统免疫的概念，在人体内使用的一种经批准的佐剂，可以是可行的口服给药诱导幽门螺旋杆菌的粘膜免疫的替代实验。进一步支持这一点，在一个单独的系列实验中，旨在探讨父母代幽门螺旋杆菌免疫对新生儿的功效，我们成功并可重复的是使用皮下免疫能获得保护性免疫。这一观点由Guy et al最近报道，介绍了新的幽门螺旋杆菌疫苗接种，这违背了长期粘膜免疫的持有原则。

    第二，相反于Guy et al.的发现，幽门螺旋杆菌需要1型免疫反应。我们的数据显示2型同1型免疫反应一样重要，且可能更有效来抵抗幽门螺旋杆菌的感染。氢氧化铝是唯一可用于人的佐剂，是引起2型免疫反应的佐剂。最近一些报告建议：保护宿主避免幽门螺旋杆菌的2型粘膜免疫的作用，包括口服途径免疫的霍乱毒素和其他实验免疫佐剂引起2型或2型1型混合型反应。